A caracterização imunofenotípica tem sido o método preferencial para a determinação da linhagem celular e análise da maturação das células nas neoplasias hematológicas. O desenvolvimento de ampla gama de anticorpos monoclonais e das potencialidades do citômetro de fluxo têm impulsionado esta área nos últimos 20 anos.

A análise multiparamétrica através da citometria de fluxo é um método rápido, objetivo e quantitativo para:
• Determinação de linhagem celular. Além de determinar a linhagem nos grandes grupos, mielóide, células B, T e NK, a caracterização imunológica contribui sobremaneira para a classificação em subgrupos  mais específicos como  a Leucemia Mielóide Aguda (LMA) com diferenciação mielóide mínima (M0 da FAB), LMA sem maturação, leucemia eritroblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda e  leucemias bifenotípicas;
• Caracterização do estadio de maturação das células malignas contribuindo na definição diagnóstica como no caso das doenças linfoproliferativas crônicas;
• Definição da linhagem celular na crise blástica de síndromes mieloproliferativas crônicas;
• No diagnóstico diferencial entre linfocitose reacional e proliferação neoplásica de células B, identificação da clonalidade através da restrição de cadeia leve de imunoglobulina;
• Caracterização da heterogeneidade e dos aspectos aberrantes das populações de células malignas, permitindo aplicar estas observações  no monitoramento da terapia e detecção de doença residual mínima.

Citometria de fluxo
A citometria de fluxo é um método rápido e objetivo que permite a determinação de múltiplas propriedades físicas simultaneamente de partículas isoladas em suspensão, em nosso caso, as células. Podemos detectar e quantificar antígenos celulares de superfície, citoplasmáticos e nucleares.

A análise pode ser realizada em sangue periférico, aspirado de medula óssea ou linfonodo, colhido com o anticoagulante EDTA, heparina ou  ACD. As amostras devem ser mantidas à temperatura ambiente (entre 18ºC e 22ºC) e, preferencialmente, o material deve ser analisado até 24 horas após a coleta.

Os anticorpos monoclonais utilizados são habitualmente submetidos aos critérios do International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, ocasião em que um grupo de laboratórios de referência avalia, caracteriza e classifica os anticorpos submetidos. O primeiro destes Workshops ocorreu em Paris em 1982 e o sétimo, na Inglaterra, em 2000.  Uma vez aceitos por este colegiado, esses anticorpos recebem a designação CD (cluster of differentiation).

Cada CD pode ser representado por vários anticorpos monoclonais que reconhecem o mesmo antígeno, mas não necessariamente o mesmo epítopo, produzidos por diferentes clones de células.  Isto explica os comportamentos diferentes entre resultados obtidos com o uso de monoclonais diversos.

A citometria de fluxo mede as propriedades de células em suspensão, orientadas num fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de LASER. As modificações ocasionadas nesse feixe de luz devidas à presença da célula serão então detectadas e mensuradas por sensores (detectores). A luz dispersa é coletada por um sistema óptico que permite identificar as células pelo seu tamanho e granularidade interna. Hemácias, plaquetas, linfócitos, monócitos e granulócitos podem ser assim identificados e quantificados (Figura 1). Os diferentes fluorocromos que marcam cada antígeno absorvem a luz e emitem-na num comprimento de onda maior e específico. Cada fluorocromo possui um padrão espectral distinto de absorção e emissão, de tal maneira que até três cores de luz podem ser opticamente separadas com os filtros seletivos encontrados nos citômetros comuns. Os antígenos são então detectados por diferentes detectores de fluorescência permitindo o estudo simultâneo de 2 a 3 antígenos (p. ex. Anti-CD45-PerCP, Anti-CD19-isotiocianato de fluoresceína e anti-CD10-ficoeritrina), utilizando-se anticorpos monoclonais específicos marcados com diferentes substâncias fluorescentes, em geral através da técnica de imunofluorescência direta. (Figura 2)

Figura 1: Citômetro de Fluxo: análise das características físicas das células – tamanho e complexidade interna.

Figura 2: Imunofluorescência Direta.

      Os fótons de luz gerados atingem detectores específicos e são convertidos em impulsos elétricos proporcionais ao número de fótons recebidos. Estes impulsos são convertidos em sinais digitais podendo oferecer os resultados em diferentes formas de análise tais como histogramas, dot-plot, tabelas entre outros. (Figura 3)

Figura 3: Representação esquemática do citômetro de fluxo.

A citometria de fluxo é  técnica rápida, precisa, quantitativa e reprodutível. A análise da população de células anômalas  é realizada através de uma “janela” que pode ser definida de duas maneiras:
1- Baseada no tamanho e complexidade interna das células, um equivalente da morfologia celular;
2- Aplicando-se uma “janela” imunológica, isto é, definem-se  populações de células  especificamente coradas por anticorpos (por exemplo, CD45 de diferentes intensidades e com determinada complexidade interna); uma vez identificada a  população de células ela é então caracterizada quanto à linhagem celular, grau de maturação ou anormalidades e quanto à coexpressão anormal de antígenos.

O diagnóstico é definido conjuntamente com dados clínicos, morfológicos e citoquímicos, citogenéticos e moleculares, baseados no padrão típico de expressão antigênica nos diferentes distúrbios caracterizados clinicamente.

No início, os esforços se dirigiam principalmente na tentativa de definir as linhagens leucocitárias (antígenos de mielóides, de células B, T e NK) e seus diversos estadios maturativos. Atualmente, além destes aspectos, têm sido estudados os antígenos de ativação, moléculas de adesão, receptores de citocinas, moléculas de células endoteliais.

Tabela 1: Principais antígenos utilizados em Hematopatologia

*cadeia pesada de imunoglobulina; **cadeia leve de imunoglobulina; TCR - receptores de células T; TdT-deoxinucleotidil transferase terminal.

O esquema abaixo demonstra a seqüência de expressão antigênica na diferenciação de células B. Exemplificamos assim a  modulação de expressão de antígenos que ocorrem nas células hematopoéticas nos seus diversos estadios maturativos sendo que alguns antígenos  se restringem a determinados estadios. (Figura 4)

Figura 4: A seqüência de expressão antigênica na  diferenciação da linhagem linfóide B

Um painel inicial permite a distinção entre LMA e LLA: os marcadores  linfóides B CD19, CD79a, CD10, CD22 cit, os marcadores linfóides T CD7, CD3 cit, os marcadores mielóides CD13, CD33, CD117 e anti-MPO e o marcador de células progenitoras CD34. O uso de um maior número de marcadores aumentará a probabilidade de se identificar uma expressão aberrante que poderá servir para acompanhamento de doença residual mínima assim como auxilia no reconhecimento de leucemias bi-linhagem (bi-clonais) e bifenotípicas.

As LLA de linhagem B são quase sempre CD19, CD79a, CD10, HLA-DR e TdT positivas. A expressão de CD20 e CD22 são variáveis.

As seguintes tabelas mostram as reatividades para os principais marcadores imunológicos nos diferentes subtipos de leucemias agudas.

Tabela 1: Classificação Imunológica das LLAs correlacionada com achado citogenético e significado prognóstico

Ig sup - imunoglobulina de superfície; CD3 cit-CD3 citoplasmático; m cit – mi citoplasmática

As leucemias mielóides agudas são definidas pela expressão de dois ou mais dos marcadores anti-MPO, CD117, CD13 e/ou CD33. O marcador mielóide mais específico é o anti-MPO seguido do CD117 (c-kit). A imunofenotipagem é crítica para o diagnóstico diferencial entre LMA mínimamente diferenciada e LLA. Na leucemia eritróide aguda, os eritroblastos em geral são negativos para os marcadores mielóides e anti-MPO e expressam glicoforina A e hemoglobina A.  Os mieloblastos expressam CD13, CD33, CD11 e anti-MPO. Na leucemia megacarioblástica aguda, o CD13, CD33 podem ser positivos, o CD34, o pan-leucocitário CD45 e o HLA-DR são freqüentemente negativos, mas expressam os marcadores para glicoproteínas plaquetárias, CD41 e CD61.

Algumas associações relevantes entre imunofenótipo e anormalidades genéticas e comportamento clínico:
• As LLA comuns com CD10+ , cadeia pesada de imunoglobulina m citoplasmática negativa (mCit -)  e CD45 de fraca intensidade, apresentam associação significativa com hiperdiploidia (>50 cromossomos) e presença do rearranjo gênico TEL-AML1 que são fatores de prognóstico favorável nas LLA em crianças;
• As LLA pré-B, em um terço dos casos, têm se associado com a t(1;19)(q23;p13) e a fusão gênica E2A-PBX1, que se associa a mau prognóstico. Esta anormalidade molecular se correlaciona com o fenótipo CD19+ CD10+  CD34- mCit +;
• A expressão de antígenos mielóides é um fator de mau prognóstico em LLAs de adultos, mas não em crianças. Apresenta uma associação com a presença da t(9;22)(q34;q11) que, quando presente, determina mau prognóstico;
• Nas LLA-T, a expressão de CD10 ocorre em 30 a 40% dos casos e associa-se a melhor prognóstico quando comparado aos casos CD10-, ainda com melhor resposta à prednisona;
• As LLA-T com CD1a  +, representam um subgrupo distinto com melhor evolução e uma melhor resposta ao corticosteróide.

Há varias associações entre perfis imunofenotípicos e subgrupos específicos de LMAs como:
• LMA mínimamente diferenciada: expressam um ou mais antígenos pan-mielóides CD13, CD33, CD117N mas não marcadores linfóides. Freqüentemente expressam CD34, CD38 e HLA-DR. Em geral, o prognóstico é desfavorável;
• Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) apresenta expressão intensa de CD33 e CD13 variável. Em geral, o HLA-DR e CD34 são negativos e quando positivos, estão presentes somente em parte da população leucêmica; o CD15 é, em geral, fracamente positivo ou então negativo. A LPA variante microgranular, além do  HLA-DR e CD34 negativos, expressam  CD2; o CD56 também pode ser positivo em alguns casos;
• LMA com t(8;21)(q22;q22): LMA com maturação, expressa, além dos antigenos mielóides CD13, CD33, e MPO, o marcador linfóide B CD19 e de CD34+ e CD56+, indicativo de prognóstico mais desfavorável. Via de regra, entretanto, esse leucemia está associado a prognóstico favorável;
• LMA com inv(16)(p13;q22), LMA mielomonocítica variante eosinofílica que, além dos marcadores mielomonocíticos habituais CD13+, CD33+, MPO +, CD14+, CD4+, CD11b+, CD11c+, CD64+  expressa frequentemente CD2 e evolui favoravelmente com o tratamento.

Entretanto, é importante ressaltar que estes fenótipos não são suficientemente específicos para que tenham um valor diagnóstico definitivo para estas subclasses, sendo freqüentemente necessária a investigação de anormalidades moleculares quando possível.

Tabela 2: imunofenotipagem das Doenças Linfoproliferativas Crônicas B

Tabela 3: Perfil Imunofenotípico das Doenças Linfoproliferativas Crônicas T leucemizadas

DLPC-T Doença Linfoproliferativa Crônica T ; LGL-T Linfocitose de Células Grandes Granulares –T;  LGL-NK     Leucemia de Células Grandes Granulares –Natural Killer; LP-T  Leucemia Pró-linfocítica T; ATLL  Leucemia Linfoma T do adulto; SS/MF  Síndrome de Sézary/Micose Fungoide

Leucemias bifenotípicas
A leucemia bifenotípica ocorre em 4 a 6% das leucemias agudas, situações em que há coexpressão de marcares mielóides e linfóides B ou T, ou ainda, a concomitância de marcadores linfóides B e T.

Alguns marcadores estão associados a determinadas linhagens celulares, mas não são específicos das mesmas sendo que a sua presença não determina uma forma bifenotípica, mas sim aberrante de um marcador.  Adotando-se o sistema de score proposto pela European Group for the Immunologic Classification of Leukaemia   (EGIL), é necessária a soma de 2,5 pontos ou mais para se assinalar cada linhagem celular. Alcançando-se essa pontuação em duas linhagens caracteriza-se leucemia bifenotípica.

Tabela 4: Sistema de score proposto pela European Group for the Immunologic Classification of Leukaemia (EGIL)

* CD79 a pode ser expresso em alguns casos de LLA T

Leucemia aguda bi-linhagem
Alguns casos de leucemias apresentam duas populações distintas de blastos, expressando marcadores de diferentes linhagens.

Leucemia indiferenciada
Em 2  a 3 % dos casos de leucemias agudas em adultos e em 1% em crianças, mesmo com o emprego de um amplo painel de marcadores, não é possível determinar a linhagem celular específica, sendo então denominados Leucemias Indiferenciadas. Estes casos não expressam antígenos linhagem-específicos como o CD79a cit (associados à linhagem B, excetuando-se alguns casos de LLA-T) , CD22 cit, CD3 e MPO. Em geral, as células blásticas são CD34+, HLA-DR+, CD38+ e CD7+.

Doença residual mínima
A detecção imunológica é mais uma ferramenta sensível  na detecção de doença residual mínima no acompanhamento de pacientes com leucemias. A combinação de certos antígenos de diferenciação expressos em blastos leucêmicos pode ser característica e estar ausente ou extremamente rara entre progenitores normais.  Isto pode ser evidenciado das seguintes maneiras:
• Expressão de antígenos de uma linhagem diferente à da leucemia em estudo, por exemplo, a expressão de CD19, ou CD2 em  mieloblastos; em  cerca de 15% das LMA, detecta-se a coexpressão de TdT com marcadores mielóides CD13 e CD33.  Em LLA de linhagem B, ocorre a presença de TdT-CD10 ou CD19-CD34 coexpressando  antígenos mielóides CD13, CD33 ou CDw65;
• Expressão assíncrona de antígenos como a coexpressão de CD34 presente em estadios precoces de maturação e CD15, presente em estadios maturativos mais tardios na série mielóide;
• Hiperexpressão, diminuição ou ausência de antigenos normalmente presentes. Estas alterações quantitativas de expressão apresentam algumas vezes, limitações técnicas sendo que as duas primeiras situações são valiosas para a monitorização de doença residual mínima.

Estes imunofenótipos anômalos passam então a ser marcadores desta população neoplásica. Esta abordagem apresenta uma sensibilidade da ordem de 1 célula neoplásica para 100.000 células normais.

*  aproximadamente 35% dos casos apresenta um fenótipo associado a leucemia
#  mais de 10% de linfoblastos leucêmicos positivos
sensibilidade 1:10.000

Campana D, Pui CH, 1995.

Conclusão
A contribuição da imunofenotipagem no diagnóstico das leucemias agudas está bem estabelecida, permitindo a definição correta da linhagem celular em cerca de 98% dos casos, dado fundamental na definição da abordagem terapêutica. Também ocupa um importante papel no diagnóstico das doenças linfoproliferativas crônicas e no monitoramento de doença residual mínima. O grande desenvolvimento do conhecimento em relação às novas moléculas da superfície da célula com um papel funcional definido, como o de enzimas de superfície, moléculas de adesão, receptores de citocinas, poderá representar uma nova abordagem permitindo classificação das leucemias em subgrupos “funcionais” contribuindo para um conhecimento crescente da biologia destas neoplasias.

Literatura recomendada
1. Campana D, Neale GA, Coustan-Smith E, Pui CH ; Detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia: the St Jude experience. Leukemia  15(2):278, 2001.
2. Stewart CC, Nicholson JKA (ed) : Immunophenotyping,   John Wiley & Sons , 2000.
3. Bene MC, Castoldi G, Knapp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfao A, van't Veer MB: Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 9(10):1783, 1995.
4. Matutes E, Owusu-Ankomah K, Morilla R, Garcia Marco J, Houlihan A, Que TH, Catovsky D: The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL.    Leukemia. 8(10):1640, 1994.
5. Basso G, Buldini B, De Zen L, Orfao A: New methodologic approaches for immunophenotyping acute leukemias.  Haematologica, 86(7):675, 2002.