Pesquisa molecular de micobactérias

Embora o isolamento em cultura seja o exame mais sensível para o diagnóstico das infecções por micobactérias – e considerado, portanto, o padrão-ouro para esse fim –, o método tem a desvantagem da demora para a obtenção dos resultados, particularmente para as espécies de crescimento lento, a exemplo daquelas que integram o complexo Mycobacterium tuberculosis.

Nesse contexto, as técnicas de Biologia Molecular têm sido cada vez mais utilizadas como ferramentas complementares, visto que a pesquisa do DNA de M. tuberculosis por reação em cadeia da polimerase (PCR) pode contribuir para o diagnóstico das micobacterioses por ser satisfatoriamente sensível e por possibilitar a identificação do complexo em menos tempo que a cultura. Dessa forma, recomenda-se que os dois exames sejam solicitados concomitantemente.

Baseada na detecção por PCR em tempo real da sequência de inserção IS6110, específica do complexo M. tuberculosis e comum a todos os seus integrantes, a técnica mais largamente utilizada é capaz de identificar os agentes M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti e M. pinnipedii –, sem, no entanto, distingui-los. Ainda assim, a informação obtida é útil, uma vez que essas micobactérias compartilham perfis de sensibilidade semelhantes e, consequentemente, a mesma conduta terapêutica.

Em comparação à cultura de escarro, a PCR em tempo real apresenta sensibilidade e especificidade próximas a 99%, quando realizadas em amostras com baciloscopia positiva. Por outro lado, nos casos em que o exame direto é negativo, a sensibilidade não ultrapassa 70% no mesmo material, de modo que um resultado negativo não exclui a hipótese diagnóstica.

Assim, pode-se dizer que a vantagem da realização da PCR para o complexo M. tuberculosis em material de vias aéreas, combinada aos métodos microbiológicos, é a associação de uma técnica mais sensível que a baciloscopia e que, diferentemente desta, é capaz de confirmar a etiologia em menos tempo que a cultura. Em espécimes clínicos provenientes de outros sítios, como líquido pleural e cefalorraquidiano, tal combinação pode aumentar a sensibilidade diagnóstica. Nos casos suspeitos com pesquisa direta e PCR negativas, porém, somente a cultura negativa pode afastar a tuberculose.

Análise em amostras não viáveis para cultura

Outra aplicação recentemente disponibilizada pelo Fleury para essa técnica molecular é a sua realização em fragmentos de tecido obtidos para análise histopatológica, que, em virtude da fixação com formol, não são viáveis para cultivo. Mesmo em biópsias incluídas em bloco de parafina, a PCR em tempo real mantém boa sensibilidade – em torno de 74% –, podendo superar os 90% quando são visualizados bacilos álcool-ácido resistentes (Baar) no tecido, situação em que sua positividade confirma a etiologia tuberculosa. Além da sequência de inserção IS6110, o ensaio amplifica um segmento do gene codificador do TNFα humano, para controle interno da reação, o que permite avaliar a qualidade do DNA extraído da amostra.

Com o objetivo de validar o uso dessa técnica em tecido fixado com formol e incluído em parafina, o setor de Microbiologia do Fleury analisou um total de 23 biópsias previamente cultivadas em meio específico para micobactérias. Das dez amostras cujas culturas foram positivas para o complexo M. tuberculosis, nove obtiveram resultados concordantes na PCR. O teste foi inconclusivo para apenas uma delas, na qual a carga bacteriana estava muito próxima do limite de detecção do método. Já entre os resultados da PCR para as 13 amostras com culturas negativas houve um positivo e um inconclusivo. No primeiro caso discordante, o resultado positivo da PCR foi confirmado no tecido fresco, razão pela qual é possível concluir que a amostra cultivada não continha agentes viáveis para crescimento. A especificidade do método foi verificada por meio da análise de diferentes patógenos, entre eles micobactérias não tuberculosis. Como esperado, todas as reações resultaram negativas.

As informações reunidas durante a validação favoreceram a implantação do teste molecular direcionado para materiais fixados, visto que apresenta vantagens como sensibilidade, reprodutibilidade e rapidez de execução, além da possibilidade de identificar o complexo M. tuberculosis em amostras inviáveis para cultura.

Diagnóstico de M. avium-intracellulare

Ainda no que diz respeito à confirmação etiológica, é importante lembrar que, em pacientes imunossuprimidos ou com DPOC, outras espécies de micobactérias têm importância, como aquelas que compõem o complexo M. avium-intracellulare (MAC). Esses agentes são especialmente relevantes no diagnóstico diferencial de tuberculose em indivíduos infectados por HIV com disfunção imunológica avançada, podendo ocorrer ainda em transplantados de células-tronco hematopoéticas e de órgão sólido. Mesmo quando não há imunossupressão de causa estabelecida, os integrantes desse grupo podem causar infecção pulmonar crônica – sobretudo em pneumopatas que apresentam alteração arquitetural do órgão – e, mais raramente, linfadenite.

Na suspeita de complexo MAC, pode ser realizada a pesquisa do DNA desses agentes por PCR em tempo real, oferecida pelo Fleury em sangue, lavado brônquico, líquido pleural, liquor e urina. Vale ressaltar que a presença dessas micobactérias em espécimes respiratórios deve ser avaliada à luz dos achados clínicos e radiológicos, além dos fatores de risco para infecção invasiva, uma vez que essas espécies podem estar presentes como colonizantes da árvore brônquica.  Outro aspecto importante é que o isolamento de micobactéria não tuberculosis, particularmente as de crescimento rápido, prejudica a detecção das espécies do complexo M. tuberculosis. Nesse cenário, a PCR específica para esse complexo é uma ferramenta indispensável.