Coagulação, anticoagulação e fibrinólise

Manuais

Publicações com orientações padronizadas dos principais métodos laboratoriais e/ou de imagem para diagnósticos específicos

13  Coagulação, anticoagulação e fibrinólise 

A formação do coágulo de fibrina no sítio de lesão endotelial constitui processo crucial para a manutenção da integridade vascular. Os mecanismos operantes nesse processo são dependentes da integridade anatômica e funcional do sistema hemostático, e devem ser finamente regulados de modo a simultaneamente contrapor-se à perda excessiva de sangue e evitar a formação de trombos intravasculares decorrentes de formação excessiva de fibrina.

Os componentes do sistema hemostático incluem as plaquetas, os vasos, as proteínas da coagulação do sangue, os anticoagulantes naturais e o sistema de fibrinólise. O equilíbrio funcional desses diferentes “setores” da hemostasia é garantido por uma variedade de mecanismos envolvendo interações entre proteínas, respostas celulares complexas, e regulação de fluxo sanguineo. No presente texto, abordaremos os sistemas de coagulação, anticoagulação e fibrinólise.

Conteúdo:

  • Coagulação

    A formação do coágulo de fibrina envolve complexas interações entre proteases plasmáticas e seus cofatores, que culminam na gênese da enzima trombina (ou fator II ativado), que por proteólise converte o fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel. Nas últimas décadas, progressos expressivos ocorreram, no que concerne à compreensão da fisiologia desse sistema e dos mecanismos que o regulam. Conforme ressaltado abaixo, esses conhecimentos levaram a melhor compreensão da fisiologia da hemostasia e do papel das reações hemostáticas em doenças hemorrágicas e trombóticas.

    Em 1964, Macfarlane e Davie & Ratnoff propuseram a hipótese da “cascata” para explicar a fisiologia da coagulação do sangue. Nesse modelo, a coagulação ocorre por meio de ativação proteolítica seqüencial de zimógenos por proteases plasmáticas, resultando na formação de trombina que então converte a molécula de fibrinogênio em fibrina. Esse modelo dividia a coagulação em uma via extrínseca (envolvendo componentes do sangue, mas também elementos que usualmente não estão presentes no espaço intravascular) e uma via intrínseca (iniciada por componentes presentes no intravascular), que convergem no ponto de ativação do fator X (“via final comum”). Na via extrínseca, o fator VII plasmático (na presença do seu cofator, o fator tecidual, também designado tromboplastina) ativa diretamente o fator X. Na via intrínseca, ativação do fator XII ocorre quando o sangue entra em contato com uma superfície contendo cargas elétricas negativas (por exemplo, a parede de um tubo de vidro). Esse processo é denominado “ativação por contato” e requer ainda a presença de outros componentes do plasma: pré-calicreína (uma serino-protease) e cininogênio de alto peso molecular (um cofator não enzimático). O fator XIIa ativa o fator XI, que por sua vez ativa o fator IX. O fator IXa, na presença de fator VIII, ativa o fator X da coagulação, desencadeando a geração de trombina e subseqüente formação de fibrina.

    Não obstante haja a tradição de se dividir o sistema de coagulação do sangue em intrínseco e extrínseco, tal separação é atualmente entendida como inadequada para entendimento da fisiologia da coagulação, tendo em vista que a divisão (em intrínseco e extrínseco) não ocorre in vivo. Em adição, alterações conceituais ocorreram desde a descrição do modelo da cascata no que diz respeito à importância relativa das duas vias de ativação da coagulação. Por exemplo, a julgar pela gravidade das manifestações hemorrágicas decorrentes das deficiências dos “fatores intrínsecos” VIII e IX (Hemofilia A e B, respectivamente), postulou-se no passado que a via intrínseca teria maior relevância na fisiologia da coagulação. Contudo, essa idéia não é de todo correta: sabe-se que a deficiência de fator XI é associada a distúrbio hemorrágico leve, e deficiências dos fatores da ativação por contato (fator XII, pré-calicreína, cininogênio de alto peso molecular) não resultam em quadro hemorrágico. Os fatores intrínsecos portanto não têm importância primária na geração de fator IXa durante o processo hemostático normal que sucede a lesão vascular. Por outro lado, a deficiência de fator VII (crucial para a “ativação extrínseca” da coagulação do sangue) é associada a quadro hemorrágico similar à Hemofilia. Em conjunto, esses dados demonstram que a ativação do fator IX não depende exclusivamente da “via intrínseca” e indicam que a coagulação do sangue é iniciada principalmente pela via do fator tecidual (“extrínseca”). Adicionalmente, experimentos conduzidos nas últimas três décadas demonstraram que as vias intrínseca e extrínseca não exibem funcionamento independente, conforme detalhado a seguir.

    Atualmente aceita-se que mecanismos hemostáticos fisiologicamente relevantes estejam associados com três complexos enzimáticos procoagulantes, os quais envolvem serino-proteases dependentes de vitamina K (fatores II, VII, IX e X) associadas a cofatores (V e VIII), todos localizados em uma superfície de membrana contendo fosfolipídeo.

    Os diferentes componentes enzimáticos da coagulação convertem seus substratos (pro-cofatores) em cofatores, os quais localizam as proteases sobre as superfícies celulares contendo fosfolipídeos (em especial das plaquetas) em que essas reações acontecem. Os elementos biológicos que contribuem para o componente de fosfolipídeos da coagulação incluem tecidos vasculares lesados, células inflamatórias e plaquetas ativadas. Os principais contribuintes (considerando o número de sítios) são as membranas de plaquetas, as quais quando ativadas expressam sítios de ligação para os complexos fator IXa/fator VIIIa (complexo “tenase”) e fator Xa/fator Va (complexo “protrombinase”). Além disso, íons cálcio são necessários em diversos passos das reações da coagulação.

    O início do processo de coagulação depende da exposição do sangue a componentes que normalmente não estão presentes no interior dos vasos, em decorrência de lesões estruturais (injúria vascular) ou alterações bioquímicas (por exemplo, liberação de citocinas). Qualquer que seja o evento desencadeante, o início da coagulação do sangue é dependente da expressão do seu componente crítico, o fator tecidual (FT), por células endoteliais e pelo monócito, e sua exposição ao espaço intravascular.

    O FT é uma glicoproteína de membrana de 45000 Da que funciona como receptor para o fator VII da coagulação. O FT não é normalmente expresso em células em contato direto com o sangue (tais como células endoteliais e leucócitos), mas apresenta expressão constitutiva em fibroblastos subjacentes ao endotélio vascular. O FT é também encontrado em queratinócitos, células epiteliais do trato respiratório e trato gastro-intestinal, cérebro, células musculares cardíacas e glomérulos renais. Células endoteliais e monócitos, que normalmente não expressam o fator tecidual, podem expressá-lo na vigência de lesão endotelial e na presença de estímulos específicos tais como endotoxinas e citocinas (TNF-a e interleucina-1). Em indivíduos normais, níveis mínimos da forma ativada do fator VII da coagulação (FVIIa) estão presentes em circulação, correspondendo a aproximadamente 1% da concentração plasmática total de fator VII. O FVIIa é capaz de se ligar ao FT expresso em membranas celulares e exposição do FT ao plasma resulta na sua ligação ao FVII e FVIIa, sendo que somente o complexo FT-FVIIa exibe função enzimática ativa; o complexo é também capaz de ativar o FVII em processo denominado “auto-ativação”. O complexo FT-FVIIa tem como substratos principais o fator IX e o fator X, cuja clivagem resulta na formação de FIXa e FXa, respectivamente, com subseqüente formação de trombina e fibrina. Deve ser salientado que quantidades mínimas de trombina são geradas a partir do complexo “protrombinase” extrínseco. Entretanto, uma vez que há gênese inicial de trombina, esta enzima é capaz de ativar o fator V em fator Va, e o fator VIII em fator VIIIa. Essas duas reações envolvendo ativação de pro-cofatores são fundamentais para a geração do complexo “tenase” intrínseco (fator IXa/fatorVIIIa), o qual converte o fator X em fator Xa, e do complexo “protrombinase” (fator Va/fator Xa), que converte a protrombina em trombina. Outro aspecto importante dessas reações é que o complexo fator IXa/fator VIIIa ativa o fator X com eficiência 50 vezes maior que o complexo fator VIIa/FT. O produto principal dessas reações, a trombina (IIa), exibe atividades procoagulantes convertendo o fibrinogênio em fibrina, promovendo ativação plaquetária e ativando o fator XIII da coagulação, que por sua vez estabiliza o coágulo de fibrina.

    A análise do conjunto de reações envolvidas na coagulação do sangue, à luz dos conceitos atuais sobre a fisiologia desses processos, mostra que não há distinção clara entre os sistemas intrínseco e extrínseco, que atuam de modo altamente interativo in vivo. Em condições fisiológicas, as reações da coagulação resultam em produção equilibrada de quantidades apropriadas de trombina e do coágulo de fibrina, em resposta adequada e proporcional à injúria vascular existente. De fato,, no estado fisiológico não há formação e deposição de fibrina no intravascular em decorrência das propriedades anticoagulantes do endotélio, à forma inativa das proteínas plasmáticas envolvidas na coagulação (que circulam como zimogênios ou cofatores), e à presença de inibidores fisiológicos da coagulação (vide infra). Por outro lado, a perda do equilíbrio dinâmico das reações da coagulação têm como conseqüência clínica o aparecimento de distúrbios hemorrágicos ou trombóticos.

    Finalmente, vale mencionar que, no que se refere ao sistema de coagulação, a utilização dos termos “intrínseco” e “extrínseco” pode ser ainda útil na interpretação de dois exames laboratoriais utilizados na rotina da avaliação da hemostasia: o TP/INR e o TTPA, que são de particular importância no diagnóstico de anormalidades hemostáticas e na monitorização de terapêutica anticoagulante. Na execução desses testes in vitro, criam-se no tubo de reação as condições para ativação preferencial das vias ditas extrínseca (avaliada pelo TP) ou intrínseca (avaliada pelo TTPA). À parte da utilidade mencionada, de caráter puramente didático e de interpretação laboratorial, a divisão do sistema de coagulação em duas vias é inadequada para a compreensão da sua fisiologia. De fato, o conceito de que o fator tecidual é o principal ativador da coagulação do sangue e de que a distinção entre sistemas extrínseco e intrínseco não existe na fisiologia desse sistema representam importantes mudanças conceituais que devem ser assimiladas para entendimento correto dos eventos bioquímicos envolvidos na ativação do sistema hemostático.

  • Mecanismos reguladores da coagulação sanguinea

    As reações bioquímicas da coagulação do sangue devem ser estritamente reguladas de modo a evitar ativação excessiva do sistema, formação inadequada de fibrina e oclusão vascular. Assim, a atividade das proteases operantes na ativação da coagulação é regulada por numerosas proteínas inibitórias que atuam como anticoagulantes naturais. No presente capítulo, discutiremos as que apresentam maior relevância biológica atuando como inibidores fisiológicos da coagulação: o TFPI (“tissue factor pathway inhibitor”), a proteína C (PC) e a proteína S (PS), e a antitrombina (AT).

    Conforme mencionado, o complexo fator VIIa/FT atua sobre dois substratos principais: os fatores IX e X da coagulação, ativando-os. Essas reações são reguladas pelo inibidor da via do fator tecidual (TFPI), uma proteína produzida pelas células endoteliais que apresenta três domínios do tipo “Kunitz”. O primeiro domínio liga-se ao complexo fator VIIa/FT inibindo-o, e o segundo domínio liga-se e inibe o fator Xa. Assim, a ativação direta do fator X é regulada negativamente de modo rápido na presença do TFPI, que limita desta forma a produção de fator Xa e fator IXa. A ligação do fator Xa é necessária para que o TFPI exerça seu papel inibitório sobre o complexo fator VIIa/FT.

    Outra importante via de anticoagulação do sangue é o sistema da PC ativada (PCa). A PC, quando ligada ao seu receptor no endotélio (EPCR, “endothelial PC receptor”), é ativada após a ligação da trombina ao receptor endotelial trombomodulina (TM). A PCa inibe a coagulação clivando e inativando os fatores Va e VIIIa. Este processo é potencializado pela PS, que atua como um cofator não enzimático nas reações de inativação. A identificação do sistema da PCa implicou importante mudança conceitual no que se refere ao papel da trombina no sistema hemostático: não obstante ela tenha função procoagulante quando gerada em excesso, sua função na fisiologia do sistema, em que é produzida apenas em pequenas quantidades, é de um potente anticoagulante, tendo em vista que sua ligação à TM endotelial representa o evento chave para ativação da via inibitória da PC.

    A AT (anteriormente designada AT III) é o inibidor primário da trombina e também exerce efeito inibitório sobre diversas outras enzimas da coagulação, incluindo os fatores IXa, Xa, e XIa. Adicionalmente, a AT acelera a dissociação do complexo fator VIIa/fator tecidual e impede sua reassociação. Desta forma, a AT elimina qualquer atividade enzimática procoagulante excessiva ou indesejável. A molécula de heparan sulfato, uma proteoglicana presente na membrana das células endoteliais, acelera as reações catalisadas pela AT. A atividade inibitória da AT sobre a coagulação é também potentemente acelerada pela heparina, um polissacarídeo linear estruturalmente similar ao heparan sulfato.

    As diferentes vias regulatórias citadas anteriormente não operam isoladamente, pois há sinergismo entre o TFPI e a AT e entre o TFPI e o sistema da PC suprimindo a gênese de trombina. Por exemplo, a AT (mas não o TFPI) inibe a ativação do fator VII mediada pelo fator Xa no complexo fator VII/FT. Por outro lado, o TFPI (mas não a AT) inibe o excesso de ativação do fator X pelo complexo fator VII/FT. Adicionalmente, o TFPI em conjunção com o sistema da PCa inibe potentemente a gênese de trombina pelo complexo fator VII/FT.

    Em condições fisiológicas (ausência de lesão vascular) há predomínio dos mecanismos anticoagulantes sobre os procoagulantes, mantendo-se desta forma a fluidez do sangue e preservando-se a patência vascular.

  • Sistema plasminogênio / plasmina (sistema fibrinolítico)

    Fibrinólise pode ser definida como a degradação da fibrina mediada pela plasmina. O sistema fibrinolítico ou sistema plasminogênio/plasmina é composto por diversas proteínas (proteases séricas e inibidores) que regulam a geração de plasmina, uma enzima ativa produzida a partir de uma pro-enzima inativa (plasminogênio) que tem por função degradar a fibrina e ativar metaloproteinases de matriz extracelular. À parte do seu papel no sistema hemostático, nos últimos anos foram descobertas numerosas funções do sistema plasminogênio/plasmina em outros processos, incluindo remodelagem da matriz extracelular, crescimento e disseminação tumoral, cicatrização e infecção, mas estes aspectos não serão aqui abordados.

    As enzimas do sistema fibrinolítico são todas serino-proteases, ao passo que os inibidores da fibrinólise são membros da superfamília de proteínas designadas serpinas (inibidores de proteases séricas). São conhecidos dois ativadores fisiológicos do plasminogênio: o ativador do plasminogênio do tipo tecidual (t-PA, “tissue-type plasminogen activator”) e o ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (u-PA, “urokinase-type plasminogen activator”). Os dois ativadores têm alta especificidade de ligação com seu substrato (plasminogênio) e promovem hidrólise de uma única ponte peptídica (Arg560-Val561) que resulta na formação de uma serino-protease ativa, a plasmina. Embora a plasmina degrade não somente a fibrina mas também o fibrinogênio, fator V e fator VIII, em condições fisiológicas a fibrinólise ocorre como processo que é altamente específico para a fibrina, portanto de ativação localizada e restrita, e não sistêmica, cumprindo desta forma sua função de remover o excesso de fibrina do intravascular de modo equilibrado. Esta especificidade dependente de fibrina é resultado de interações moleculares específicas entre os ativadores do plasminogênio, o plasminogênio, a fibrina, e os inibidores da fibrinólise. Por exemplo, o t-PA exibe baixa afinidade pelo plasminogênio na ausência de fibrina (KM = 65 mM), afinidade que é muito aumentada na presença de fibrina (KM = 0,15-1,5 mM). Isto ocorre porque a fibrina representa uma superfície ideal para ligação do t-PA ao plasminogênio, e nesta reação o plasminogênio liga-se à fibrina via resíduos de aminoácido lisina (“lysine-binding sites”). Em contraste com esses mecanismos fisiológicos, ativação mais extensa do sistema fibrinolítico ocorre quando da infusão de agentes trombolíticos do tipo estreptoquinase e uroquinase, que não são específicos para a presença de fibrina.

    A inibição do sistema fibrinolítico ocorre em nível dos ativadores do plasminogênio mediante ação de inibidores específicos (PAIs, “plasminogen activator inhibitors”), cujo principal representante é o PAI-1, e diretamente sobre a plasmina, função inibitória esta exercida pela a2-antiplasmina.

    Recentemente, um novo componente do sistema fibrinolítico foi identificado e designado TAFI (“thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor”, inibidor da fibrinólise ativado pela trombina, também denominado carboxipeptidase B plasmática, pro-carboxipeptidase U ou pro-carboxipeptidase R). O TAFI é um zimogênio plasmático que ocupa importante papel na hemostasia funcionando como um potente inibidor da fibrinólise. O TAFI é ativado pela trombina, tripsina e plasmina, e na sua forma ativada é capaz de inibir a fibrinólise por remover resíduos de lisina da molécula de fibrina durante o processo de lise do coágulo, suprimindo assim as propriedades de cofator da fibrina parcialmete degradada na ativação do plasminogênio. Curiosamente, a principal via de ativação do TAFI é dependente da ligação do fator IIa (trombina) à trombomodulina (complexo que tem também a função de ativar o sistema da proteína C). Desta forma, a molécula do TAFI representa um ponto de conexão entre os sistema de coagulação e fibrinolítico.

  • Referências bibliográficas

    Referências bibliográficas
    1. JENNY NS & MANN KG. Coagulation cascade: an overview. In: Loscalzo J & Schafer AI, ED. Thrombosis and hemorrhage (2nd ed.), Williams & Wilkins, Baltimore, MA, USA, p. 3-27, 1998.
    2.COLMAN RW; CLOWES AW; GEORGE JN; HIRSH J & MARDER VJ. Overview of hemostasis. In: Colman RW; Hirsh J; Marder VJ; Clowes AW & George JN, ed. Hemostasis and thrombosis. Basic principles and clinical practice (4th ed.), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, p. 3-16, 2001.
    3.MACFARLANE RG. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier. Nature 202:498-499, 1964.
    4.DAVIE EW & RATNOFF OD. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science 145:1310-1312, 1964.
    5.DRAKE TA; MORRISSEY JH & EDGINGTON TS. Selective cellular expression of tissue factor in human tissues: implications for disorders of hemostasis and thrombosis. Am J Pathol 134:1087-1097, 1989.
    6.WILCOX JN; SMITH KM; SCHWARTZ SM; SCHWARTZ SM & GORDON D. Localization of tissue factor in the normal vessel wall and in the atherosclerotic plaque. Proc Natl Acad Sci USA 86:2839-2843, 1989.
    7.VAN DEVENTER SJH; BULLER HR; TEN CATE JW; AARDEN LA; HACK CE & STURK A. Experimental endotoxemia in humans: analysis of cytokine release and coagulation, fibrinolytic and complement pathways. Blood 76:2520-2527, 1990.
    8.FRANCO RF; DE JONGE E; DEKKERS PEP; TIMMERMAN JJ; SPEK CA; VAN DEVENTER SJH; VAN DEURSEN P; VAN KERKHOFF L; VAN GEMEN B; TEM CATE H; VAN DER POLL & REITSMA PH. The in vivo kinetics of tissue factor mRNA expression during human endotoxemia: relationship with activation of coagulation. Blood 2000; 96:554-559.
    9.COLMAN RW; HIRSH J; MARDER VJ; CLOWES AW. Overview of coagulation, fibrinolysis, and their regulation. In: Colman RW; Hirsh J; Marder VJ; Clowes AW & George JN, ed. Hemostasis and thrombosis. Basic principles and clinical practice (4th ed.), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, p. 3-16, p. 17-20, 2001.
    10. COLLEN D. The plasminogen (fibrinolytic) system. Thromb Haemost 82:259-270, 1999.
    11. BAJZAR L. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and na antifibrinolytic pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20:2511-2518, 2000.